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迪拜世博会丨大咖解读下一代分子诊断技术:CRISPR/Cas系统

理想的病原体核酸检测方式应该是准确、灵敏、快速、廉价、便携,并且能在各种环境下对任何病原体进行检测。

2022-04-08
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导语

理想的病原体核酸检测方式应该是准确、灵敏、快速、廉价、便携,并且能在各种环境下对任何病原体进行检测。近年来,基于成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)的新型分子诊断工具,似乎具有成为这样理想化核酸检测平台的潜力。

01
下一代分子诊断技术!

从1987年首次发现CRISPR, 到最近几年CRISPR-associated(Cas)技术的广泛应用,以及2020年的诺贝尔化学奖颁给了CRISPR的发现者,CRISPR技术被誉为会改变和造福人类的发明。短短几年时间,CRISPR技术成为科研界的热门内容,被称为下一代分子诊断技术!

2020诺贝尔化学奖得主:

Emmanuelle Charpentier教授、Jennifer Doudna教授


而关于CRISPR技术在临床领域及新冠检测方面的应用,也成为了近期的讨论热点。中国科学院赵国屏院士、复旦大学附属中山医院胡必杰主任在2020迪拜世博会中国馆上海日《走近威尼斯wns8885556, 了解新冠抗疫中国方案、中国速度》专题直播中,围绕着新冠核酸快速检测技术,带来了关于CRISPR技术干货满满的分享与讨论。

02
从新冠核酸检测说开去

在专题讲座《速度为先 | 新冠核酸快速检测技术的应用及展望》中,胡必杰教授提出对于现在新型冠状病毒,国家提到了快速检测,上海市自10月28日起,全市首批21家二级以上综合性医疗机构面向市民提供24小时核酸检测服务,争取6小时出报告,对于现在新冠快速核酸检测技术,与赵院士一起探讨了值得期待和进一步开发的技术和应用。

赵国屏院士以新冠为例,讲到对于一个“好的”临床检验产品,有5个关键要求:


第一,就是要正确,不能“错怪好人”,不能出现“假阳性;必须准确,不能“张冠李戴”,专一性、特异性要好。第二一定要灵敏,也就是说不能“放过坏人”,不能出现假阴性。第三最好能够“定量”。定量是确定检测结果准确与否的重要佐证。第四,要快速,简便;第五成本要尽可能低


胡必杰教授表示,赵院士提到的“不抓错好人”、“不放过坏人”,同时定量,让临床医生更加精准地去辨别是感染的病原体还是污染的病原体,同时简捷方便与价优,是非常重要的。如果一项分子诊断技术非常昂贵,很多病人享受不到,只有达到以上五点要求,这项技术才能广泛应用到临床,最终让老百姓和普通病人得益。

03

等温扩增与CRISPR诊断技术

的有机结合


而后赵院士提到,在过去几十年的时间里,等温扩增技术得到了极大的发展,现有也已经开发了很多种方法体系,包括经典LAMP技术和RPA技术。等温扩增有快速灵敏,对仪器要求低,是分子POCT诊断领域重要的技术力量。

第二项技术即是最近发展的CRISPR诊断技术。主流CRISPR诊断技术主要基于CRISPR-Cas12或Cas13来开发,利用了Cas蛋白“反式切割活性”,可以将体系中的单链核酸高效的切割。


所以,CRISPR诊断的原理就是:当待检体系中存在靶标核酸时,Cas蛋白在向导RNA的引导下特异识别靶标序列,形成复合物,进而被激发出针对切割单链核酸的“反式切割活性“,将体系中的荧光标记探针切碎,发出荧光信号,完成检测过程,通过检测体系是否发光来判断靶标核酸是否存在。


将恒温扩增和CRISPR诊断技术结合起来,既可以利用恒温扩增的快,灵敏和简便,又可以利用CRISPR的特异和灵敏,在进行快检的同时,既不用担心检测的假阳性和假阴性问题,也不用担心PCR检测中不确定的“灰区”问题。

对于威尼斯wns8885556利用由其实验室开发的,吐露港公司授权的CRISPR诊断专利技术,成功开发的国内首款CRISPR快检一体机BG-Nova-X8,院士对其速度和通量表示了赞赏,认为仪器可以在30-40分钟内完成24个新冠标本检测,可以期待这个系统能够为新冠快检多做贡献。

赵院士提到,未来技术的展望,等温扩增的特异性和灵敏度都需要进一步提升,可以通过和别的技术结合,“取长补短”来提升检测特异性和灵敏度,这一次威尼斯wns8885556将等温扩增与CRISPR技术的尝试,就是迈出了可喜的一步。


等温扩增的一管多重问题还需要创新的思路或者原理方面的突破,另一方面把恒温扩增,CRISPR诊断技术,和数字PCR技术的绝对定量原理结合起来,来实现绝对定量,在未来有更多发展的可能性。 

04
CRISPR技术的未来研究方向

可以说,CRISPR/Cas系统毫无疑问为感染性疾病的诊断提供了新的方法和契机,总结来说,它具有如下优点:



相较于基于PCR的传统方法,毫不逊色的灵敏度和特异度


检测所需时间短


简单便携,不依赖昂贵的仪器和严苛的实验环境


试剂耐受冷冻干燥,便于储存和携带


标本前处理可以非常简单


结果读取方便,能通过荧光或者肉眼读取结果

这几大优点使得CRISPR检测平台可以对病原体核酸分子实现实时快速检测。根据以上的分析,未来CRISPR技术的两大研究方向也初见雏形:


第一,是新的Cas蛋白的开发及突变体的筛选鉴定。例如后来发现的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅长识别单链DNA,丰富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的筛选鉴定为提高检测通量及降低“脱靶效应”提供了方法。


第二,是将CRISPR/Cas其和其他的技术平台结合起来,开发新颖实用的生物传感策略。比如将Cas9蛋白固定于石墨烯场效应晶体管,以及将Cas系统的报告探针固定于电极上,从而实现不需要使用信号扩增的电化学生物传感器的构建。使用水凝胶作为其响应原件实现多样化的信号输出。与微流体技术结合开发出的CARMAN技术,可以对数十个样本,上百种病毒进行快速检测,为解决通量低的问题提供了方法等。


不断地将新兴的材料与技术与CRISPR技术结合实现优势互补,开发出更实用新颖的检测策略用于感染性疾病诊断,将是未来一段时间内的研究重点。


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上海威尼斯wns8885556科技有限公司是一家致力于感染性病原体分子诊断试剂研发和应用,深耕于多重荧光PCR诊断试剂和痕量病毒二代测序试剂及相关服务的国家高新技术企业。公司围绕感染性病原体这一主线,从诊断试剂、诊断仪器、测序服务和医检所服务等多个面提供全套解决方案。公司秉承“勇于创新,质量为先”的方针,为医疗机构、疾控公卫、高校科研等合作伙伴提供优质产品与服务。

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